Alas bedak Gram, bahan, teknik dan penggunaan



itu Noda Gram adalah teknik pewarnaan yang paling sederhana dan paling berguna dalam diagnostik mikrobiologi. Teknik ini dibuat oleh dokter Denmark Hans Christian Gram pada tahun 1884, yang berhasil mengklasifikasikan bakteri dalam Gram positif dan Gram negatif, sesuai dengan komposisi dinding sel..

Teknik ini mengalami modifikasi tertentu oleh Hucker pada tahun 1921 untuk menstabilkan reagen dan meningkatkan kualitas noda, sehingga pewarnaan Gram juga dikenal sebagai Gram-Hucker.

Dengan teknik ini juga dimungkinkan untuk mengamati bentuk yang dimiliki mikroorganisme, yaitu, apakah mereka cocci, basil, coccobacilli, pleomorfik, berserabut, dan lainnya. Serta distribusinya dalam ruang: dalam kelompok, rantai, terisolasi, berpasangan, dalam tetrad, dll..

Ketika dicurigai adanya infeksi bakteri, sebagian besar sampel yang diterima harus disebarkan pada slide dan diwarnai dengan Gram untuk diperiksa di bawah mikroskop..

Laporan Gram akan memandu dokter tentang jenis mikroorganisme apa yang dapat menjadi penyebab infeksi, sebelum mendapatkan hasil akhir dari tanaman tersebut..

Dalam beberapa kasus kehidupan pasien sangat terganggu, sehingga dokter sangat membutuhkan laporan Gram untuk menempatkan pengobatan empiris, sambil menunggu identifikasi mikroorganisme..

Sebagai contoh, jika Gram mengungkapkan bahwa ada cocci Gram positif dalam cairan serebrospinal, dokter akan mengarahkan terapi awal dengan antibiotik yang menghilangkan bakteri jenis ini, sesuai dengan protokol yang ditetapkan untuk itu..

Setelah hasil akhir tiba dengan nama mikroorganisme terisolasi dan antibiogram masing-masing, dokter akan mengevaluasi apakah akan mengubah terapi atau tidak. Keputusan ini akan dibuat sesuai dengan studi kerentanan mikroorganisme terhadap antibiotik yang diterimanya dan evolusi pasien..

Indeks

  • 1 Yayasan
  • 2 Bahan
  • 3 Persiapan pewarna dan pereaksi
    • 3.1 Solusi kristal violet
    • 3.2 Iodo-Lugol
    • 3.3 Pemutihan
    • 3.4 Kontras
  • 4 Penyimpanan reagen
  • 5 Persiapan penyebaran sampel yang akan diwarnai
    • 5.1 -Gram sampel langsung
    • 5.2 -Gram tanaman
  • 6 Teknik
  • 7 Utilitas
  • 8 Kesalahan umum
  • 9 Referensi

Yayasan

Ini adalah teknik yang menghadirkan 4 langkah mendasar: pewarnaan, fiksasi dengan mordan, perubahan warna dan kontrasepsi. Karena itu, teknik ini selain mewarnai bakteri, juga membedakannya.

Kristal ungu adalah pewarna pertama yang digunakan. Ini memiliki afinitas untuk peptidoglikan dan ungu akan menodai semua bakteri yang ada, kemudian lugol ditempatkan, yang bertindak sebagai mordan, yaitu, ia akan menginduksi pembentukan kompleks kristal violet-iodine - protein ribonuclear yang tidak larut di dalam sel..

Bakteri Gram-positif, memiliki dinding peptidoglikan yang tebal, membentuk lebih kompleks (kristal violet-iodine), oleh karena itu mereka mempertahankan pewarna.

Ini juga mempengaruhi bahwa dinding bakteri Gram-positif mengandung sejumlah besar asam tak jenuh, yang menunjukkan afinitas tinggi untuk agen pengoksidasi (Lugol).

Sementara itu, bakteri Gram-negatif memiliki lapisan tipis peptidoglikan, yang membuat bakteri lebih kompleks daripada bakteri Gram-positif.

Kemudian muncul langkah perubahan warna, di mana bakteri Gram positif dan Gram negatif berperilaku berbeda.

Bakteri gram negatif mengandung membran luar yang kaya akan lipopolysaccharides yang merupakan bagian dari dinding selnya. Lemak dihancurkan oleh kontak dengan alkohol aseton, sehingga membran luarnya tidak stabil, kristal ungu dilepaskan.

Ini adalah bagaimana ia kemudian dinetralkan dengan safranin atau fuchsin dasar, mengambil warna merah.

Dalam kasus bakteri Gram-positif, mereka menolak perubahan warna karena pemutih bertindak untuk menutup pori-pori, yang mencegah kompleks kristal violet / yodium keluar..

Oleh karena itu, warna dengan kristal violet stabil, dan tidak ada ruang untuk safranin atau fuchsin. Karena itu, bakteri ini bernoda intens biru atau ungu.

Materi

Set pewarnaan Gram terdiri dari:

  • Kristal ungu
  • Lugol
  • Alkohol aseton
  • Safranin atau fuchsin dasar

Persiapan pewarna dan pereaksi

Solusi kristal violet

Solusi a:

Kristal ungu -2 gr

Etil alkohol 95% -20cc

Solusi B:

Ammonium oxalate -0,8 gr

Air suling-80 cc

Untuk persiapan akhir kristal violet, larutan 1:10 harus diencerkan dengan air suling dan dicampur dengan 4 bagian larutan B. Campuran disimpan selama 24 jam sebelum digunakan. Ini disaring dalam labu untuk pewarnaan kuning menggunakan kertas saring.

Jumlah yang akan digunakan setiap hari ditransfer ke botol kuning dengan pipet.

Iodo-Lugol

Timbang dan ukur jumlah yang ditunjukkan dari masing-masing senyawa, sebagai berikut:

Kristal Iodo --1gr

Potassium Iodide - 2gr

Air suling -300 cc

Kalium iodida larut sedikit demi sedikit di dalam air dan kemudian ditambahkan yodium. Solusinya dicukur ke botol berwarna kuning.

Jumlah yang akan digunakan setiap hari ditransfer ke botol amber yang lebih kecil dengan pipet.

Pemutihan

95% etil alkohol -50 ml

Aseton - 50 ml

Itu disiapkan dalam bagian yang sama. Tutupi dengan baik, cenderung menguap.

Tempatkan dalam botol dengan pipet.

Persiapan ini memberikan perubahan warna dalam waktu moderat 5-10 detik dan paling direkomendasikan.

Para pemula lebih suka menggunakan hanya 95% etil alkohol, di mana perubahan warna lebih lambat dari 10 hingga 30 detik.

Sedangkan yang paling berpengalaman bisa menggunakan aseton murni, di mana perubahan warna terjadi sangat cepat dari 1 hingga 5 detik.

Kontras

Solusi stok safranin

Safranina -2,5 gr

Etil alkohol 95% -100 cc

Setelah menimbang jumlah yang ditunjukkan, safranin dilarutkan dalam 100 cc etil alkohol hingga 95%.

Solusi safranin yang bekerja disiapkan dari larutan stok.

Untuk melakukan ini, ukur 10 cc larutan stok, tambahkan 90 cc air suling hingga 100 ml.

Disarankan untuk mentransfer jumlah yang akan digunakan setiap hari ke botol kuning dengan pipet.

Mikroorganisme yang bernoda Gram negatif lemah dengan pewarnaan Gram-Hucker, seperti anaerob tertentu, Legionella sp, Campylobacter sp dan Brucella sp, mereka bisa lebih ternoda jika modifikasi yang dilakukan oleh Kopeloff ke pewarnaan Gram-Hucker, yang disebut pewarnaan Gram-Kopeloff, digunakan.

Teknik ini mengubah pewarna safranin dengan fuchsin dasar. Dengan modifikasi ini dimungkinkan untuk secara efektif mewarnai mikroorganisme yang disebutkan di atas.

Penyimpanan reagen

Pewarna yang disiapkan harus disimpan pada suhu kamar.

Persiapan penyebaran sampel ke warna

Sampel harus mengandung setidaknya 105 mikroorganisme sebelum pengamatan mikroorganisme pada apusan mungkin terjadi. Spread dapat dibuat dari sampel langsung atau kultur dalam media padat atau cair.

Sebaran harus seragam, terdistribusi dengan baik dan tidak terlalu tebal, untuk visualisasi struktur yang lebih baik.

-Gram sampel langsung

Gram urin tanpa centrifuge

Urin dicampur dan 10 μl ditempatkan pada slide. Pengamatan setidaknya satu bidang bakteri / perendaman menunjukkan bahwa ada infeksi.

Ini berarti bahwa biakan akan memiliki lebih dari 100.000 CFU / ml (105 CFU / mL) urin pada 85% kasus.

Metode ini tidak berguna untuk jumlah koloni di bawah 100.000 CFU.

LCR Gram

CSF harus disentrifugasi, supernatan dilepas dan pellet menyebar pada slide. Cairan ini steril dalam kondisi normal; pengamatan bakteri menunjukkan infeksi.

Gram sampel pernapasan

Sputum Gram, lavage bronkial atau bronchoalveolar, meskipun mungkin ada berbagai mikroorganisme, akan selalu membimbing dalam diagnosis, selain berguna jenis sel yang diamati.

Dalam kasus dahak, apusan harus disiapkan dengan bagian sampel yang paling purulen.

Gram tinja

Tidak disarankan untuk melakukan Gram pada sampel jenis ini, karena tidak memiliki nilai diagnostik.

-Tanaman Gram

Mereka dapat dilakukan dengan dua cara, satu dari tanaman cair dan lainnya dari tanaman padat.

Tanaman cair

Dari kultur cair itu sangat sederhana; di bawah pemantik beberapa daging dari kaldu keruh diambil dan mereka ditempatkan pada slide yang bersih dan kering, memberikan gerakan melingkar dari pusat ke pinggiran, untuk mendistribusikan material secara seragam.

Itu dibiarkan mengering secara spontan di udara. Setelah kering, bahan diperbaiki ke lembaran dengan panas. Untuk ini, dengan bantuan penjepit, lembaran 3 dilewatkan 4 kali melalui nyala api pembakar Bunsen, berhati-hatilah agar tidak membakar bahan tersebut..

Lembar dibiarkan dingin dan ditempatkan di jembatan pewarnaan.

Tanaman padat

Untuk melakukan ekstensi pewarnaan Gram dari kultur padat, lakukan sebagai berikut:

Sebelum memilih koloni yang akan diambil, slide harus disiapkan, menempatkan dua tetes kira-kira larutan garam fisiologis steril.

Jika lempeng kultur asli berisi beberapa jenis koloni yang berbeda, sebuah koloni yang terisolasi masing-masing akan dipilih untuk melakukan Gram. Setiap koloni akan diambil dengan loop platinum untuk melarutkannya dalam larutan garam yang sebelumnya ditempatkan pada slide.

Gerakan melingkar diberikan dari pusat ke pinggiran, untuk mendistribusikan koloni secara homogen pada slide..

Itu dibiarkan mengering secara spontan di udara. Setelah kering, lembaran tersebut diperbaiki dengan panas, seperti dijelaskan di atas (nyalakan kaca objek dengan pemantik api), berhati-hatilah untuk tidak membakar bahan tersebut..

Prosedur ini harus dilakukan dengan setiap jenis koloni yang berbeda. Di selembar kertas, urutan yang diamati harus diperhatikan, misalnya:

Koloni 1: Koloni beta-hemolitik kuning: Kokus Gram-positif diamati dalam kelompok

Koloni 2: Koloni krim, tanpa hemolisis: Gram coccobacilli negatif diamati.

Setiap lembar harus diberi label untuk mengetahui apa yang kita amati.

Teknik

Teknik pewarnaan gram sangat sederhana untuk dilakukan dan relatif murah dan tidak dapat dilewatkan di laboratorium mikrobiologi.

Hal yang sama dilakukan sebagai berikut:

  1. Perbaiki apusan dengan panas dan letakkan di jembatan berwarna.
  2. Lembar tertutup sepenuhnya dengan kaca violet selama 1 menit.
  3. Cuci dengan air. Jangan sampai kering
  4. Tutup piring dengan larutan Lugol, diamkan selama 1 menit. Cuci dengan air. Jangan sampai kering.
  5. Blender selama 5-10 detik dengan agitasi lembut dalam alkohol aseton. Atau letakkan lembaran kertas dalam posisi tegak dan jatuhkan tetesan zat penghilang warna pada permukaan sampai kaca violet yang tersisa diseret. Jangan melebihi.
  6. Cuci dengan air. Jangan sampai kering.
  7. Ganti lembar pada jembatan berwarna dan tutup selama 30 detik dengan safranin (Gram-Hucker) atau 1 menit dengan fuchsin dasar (Gram-Kopeloff).
  8. Cuci dengan air
  9. Biarkan mengering secara spontan di udara vertikal.

Setelah kering, tempatkan 1 tetes minyak imersi untuk mengamatinya di bawah tujuan 100X dalam mikroskop optik.

Utilitas

Teknik ini memungkinkan untuk membedakan perbedaan morfotipeintis sebagian besar bakteri.

Ragi juga dibedakan oleh warna ini. Mereka mengambil kristal ungu, yaitu, mereka menodai Gram positif.

Di sisi lain, basil pembentuk spora Gram positif dapat dibedakan, di mana ruang yang jelas diamati di dalam basil, di mana endospore terbentuk, meskipun spora tidak bernoda dengan baik. Untuk menggunakan spora, teknik lain seperti Shaeffer-Fulton digunakan.

Perlu dicatat bahwa pewarnaan ini tidak berfungsi untuk mewarnai semua jenis bakteri, yaitu, ada beberapa kasus di mana pewarnaan tidak bekerja..

Dalam hal ini, bakteri yang tidak memiliki dinding sel dapat disebutkan. Sebagai contoh: genus Mycoplasma, spheroplasts, Ureaplasma, L-bentuk dan protoplas.

Ini juga menodai bakteri jahat dengan dinding yang kaya akan asam mikolik, seperti Mycobacteria dan bakteri intraseluler seperti Chlamydias dan Rickettsias.

Juga tidak efisien untuk menodai sebagian besar bakteri spirochet.

Ada bakteri dari genus yang sama yang dapat diamati dalam sampel yang sama dengan Gram positif dan Gram negatif. Ketika ini terjadi itu disebut pewarnaan Gram variabel, yang mungkin disebabkan oleh perubahan nutrisi, suhu, pH atau konsentrasi elektrolit..

Kesalahan umum

Pemutih berlebihan

Membesar-besarkan pada langkah perubahan warna dapat menyebabkan pengamatan mikroorganisme gram negatif palsu.

Jangan menunggu waktu pengeringan yang cukup untuk menambahkan minyak imersi:

Kesalahan ini menyebabkan pembentukan misel lemak yang membuatnya sulit untuk mengamati struktur yang ada. Ini terjadi ketika minyak bergabung dengan molekul air yang ada dalam apusan.

Membalikkan urutan reagen:

Kesalahan seperti ini akan menyebabkan bakteri Gram-negatif menampilkan ungu, yaitu, Gram-positif palsu.

Gunakan tanaman lama (padat atau cair):

Ini dapat menyebabkan bakteri Gram positif menodai Gram negatif (false Gram negative). Hal ini terjadi karena dalam kultur lama kemungkinan ada bakteri mati atau memburuk dan dalam kondisi ini bakteri tidak mempertahankan kristal ungu..

Gunakan solusi Lugol yang sangat lama:

Seiring waktu lugol kehilangan sifat dan warnanya memudar. Jika reagen yang sudah terdegenerasi digunakan, itu tidak akan memperbaiki violet kristal dengan baik, karena itu ada kemungkinan mendapatkan visualisasi mikroorganisme palsu Gram negatif.

Latar belakang kebiru-biruan

Latar belakang yang benar-benar berubah warna akan merah. Latar belakang biru menunjukkan bahwa perubahan warna tidak cukup.

Referensi

  1. Ryan KJ, Ray C. 2010. Sherris. Mikrobiologi Medis, edisi ke-6 McGraw-Hill, New York, AS
  2. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnosis mikrobiologis. (Edisi ke-5). Argentina, Editorial Panamericana S.A..
  3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Diagnosis mikrobiologis dari Bailey & Scott. 12 ed. Argentina Editorial Panamericana S.A
  4. Casas-Rincón G. 1994. General Mycology. Edisi 2 Universidad Central de Venezuela, edisi Perpustakaan. Venezuela, Caracas.
  5. "Noda Gram" Wikipedia, Ensiklopedia gratis. 4 Okt 2018, 23:40 UTC. 9 Des 2018, 17:11. Diambil dari es.wikipedia.org.
  6. González M, González N. 2011. Manual of Mikrobiologi Medis. Edisi ke-2, Venezuela: Direktorat media dan publikasi Universitas Carabobo.
  7. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. Pewarnaan dasar di laboratorium mikrobiologi. Penelitian tentang Disabilitas. 2014; 3 (1): 10-18.