Yayasan uji, persiapan dan penggunaan Voges-Proskauer



itu Tes Voges-Proskauer adalah tes biokimia yang digunakan untuk membantu mengidentifikasi bakteri milik keluarga Enterobacteriaceae. Terutama itu berguna untuk membedakan strain Escherichia coli dari Klebsiella dan Enterobacter, antara lain.

Tes ini dilakukan dalam media kultur cair yang disebut metil merah-Voges Proskauer, yang lebih dikenal dengan akronim RM / VP. Media ini terdiri dari polipepton buffer, glukosa, dipotassium fosfat dan air suling.

Medium RM / VP saat ini adalah modifikasi dari medium Clark dan Lubs, yang awalnya mengandung konsentrasi pepton dan glukosa yang lebih rendah. Oleh karena itu, ion hidrogen lebih sedikit diproduksi, diperlukan untuk reaksi Voges-Proskauer positif.

Tes ini didasarkan pada kemampuan mikroorganisme untuk menggunakan glukosa melalui rute butilen glikol, dan membentuk produk akhir netral yang disebut asetoin, dengan adanya oksigen dan pH basa.

Dalam medium RM / VP, selain mampu mengungkapkan tes Voges-Proskauer, tes metil merah juga dapat diungkapkan.

Indeks

  • 1 Yayasan
    • 1.1 Dasar uji Voges-Proskauer
    • 1.2 Dasar untuk pengembangan tes dan interpretasi
  • 2 Persiapan
    • 2.1 Medium RM / VP
    • 2.2 Voges A Reagent
    • 2.3 Voges B Reagent
  • 3 Prosedur uji Voges-Proskauer
    • 3.1 Pengembangan tes
  • 4 Gunakan
  • 5 Kontrol kualitas
  • 6 Referensi

Yayasan

Dasar tes Voges-Proskauer

Pluripeptona yang ada dalam medium menyediakan kebutuhan nutrisi yang penting untuk pertumbuhan bakteri. Untuk bagiannya, glukosa adalah senyawa utama. Banyak bakteri memiliki kemampuan untuk memetabolisme glukosa dan membentuk asam piruvat.

Asam piruvat adalah titik tengah dalam metabolisme glukosa dan dari sana masing-masing mikroorganisme dapat mengambil rute yang berbeda. Beberapa akan membentuk asam campuran, seperti asam laktat, asam asetat, asam format dan asam suksinat, dan yang lain akan membentuk produk netral seperti 2,3-butanadiol.

Tes Voges-Proskauer mengungkap kemampuan mikroorganisme untuk membentuk asetil metil karbinol (acetoin), produk antara 2,3-butanediol dalam kondisi aerob.

Acetoin berkurang dan membentuk 2,3-butanediol, tetapi reaksi ini reversibel, jadi jika 2,3-butanediol dioksidasi, acetoin terbentuk. Karena itu, oksigen sangat penting.

Dipotassium fosfat adalah penyangga yang meredam campuran pada pH 6,9 ± 0,2..

Dasar untuk pengembangan tes dan interpretasi

Untuk menunjukkan reaksi, pengembangan harus dilakukan dengan menggunakan dua reagen (reagen Barrit), yang dikenal sebagai Voges A dan Voges B.

Voges A adalah larutan 5% dari α-naphthol, dan Voges B adalah persiapan kalium hidroksida 40%. Jika kalium hidroksida tidak tersedia, dapat diganti dengan natrium hidroksida 40%.

Α-naphthol adalah katalis yang akan meningkatkan intensitas warna reaksi, yang membuat tes lebih sensitif. Α-naphthol harus selalu ditambahkan terlebih dahulu, aduk tabung sehingga media bersentuhan dengan oksigen. Dengan cara ini, acetoin yang ada dioksidasi menjadi diacetyl, dan 2,3-butanediol dioksidasi untuk membentuk acetoin, meneruskannya ke diacetyl.

Ini adalah bagaimana α-naphthol akan berikatan dengan diacetyl, yang pada gilirannya telah dikaitkan dengan nukleus guanidin yang ada dalam asam amino arginin, yang terakhir berasal dari pluripeptonas..

Untuk bagiannya, kalium atau natrium hidroksida bertanggung jawab untuk menyerap CO2 dan bereaksi dengan pepton. Reaksi ini menyebabkan pembentukan warna pink-salmon, terlihat jelas setelah mengocok tabung dengan sangat baik.

Agar pewarnaan terjadi secara instan, jumlah diacetyl, peptone dan α-naphthol yang benar harus dicampur. Jika ini tidak terjadi, biarkan tabung beristirahat selama 15 menit sebelum menerjemahkan.

Biasanya tes positif setelah 2 hingga 5 menit, ketika warna merah muda yang lemah dapat diamati. Jika dibiarkan diam selama 30 menit hingga 1 jam, intensitas warna akan maksimal (merah tua).

Tes negatif akan terbukti ketika kaldu berwarna kuning. Setelah 1 jam, jika tes negatif, warna tembaga dapat terbentuk sebagai hasil dari reaksi kalium hidroksida pada α-naphthol.

Persiapan

RM / VP sedang

Timbang 17 g media kultur dehidrasi dan larutkan dalam satu liter air suling. Diamkan selama 5 menit. Panaskan sampai mendidih hingga larut sepenuhnya. Sajikan 3 hingga 4 ml dalam tabung dan sterilkan dalam autoklaf pada 121 ° C selama 15 menit.

Media kultur dehidrasi berwarna krem ​​dan medium yang disiapkan berwarna kuning muda.

PH akhir medium adalah 6,9 ± 0,2.

Voges A Reagent

Timbang 5 g α-naphthol dan larutkan dalam 50 ml etil alkohol (absolut). Selanjutnya terus menambahkan etil alkohol hingga 100 ml.

Reagent Voges B

Timbang 40 g kalium hidroksida dan larutkan dalam 50 ml air suling dalam gelas kimia. Gelas harus ditempatkan di bak air dingin untuk mengontrol suhu, karena pada saat melarutkan persiapan naik tajam.

Setelah larutan itu dingin, ia dipindahkan ke balon yang bertingkat dan dibawa hingga 100 mL dengan air suling.

Prosedur uji Voges-Proskauer

Untuk melakukan tes Voges-Proskauer, kaldu RM / VP diinokulasi dengan mikroorganisme yang diteliti, dari kultur murni 18 hingga 24 jam.

Inokulum tidak boleh terlalu padat. Itu diinkubasi pada 35-37 ° C selama 24 hingga 48 jam, meskipun kadang-kadang diperlukan untuk beberapa hari. Cowan dan Steel percaya bahwa 5 hari adalah waktu inkubasi minimum yang diperlukan untuk mendeteksi semua spesies Voges-Proskauer (VP) positif dari keluarga Enterobacteriaceae.

Pengembangan tes

Pisahkan alikuot 1 mL dalam tabung dan lakukan pengembangan sebagai berikut: tempatkan 12 tetes (0,6 mL) reagen Voges A dan 4 tetes (0,2 mL) Voges B. Campur untuk diangin-anginkan dan diamkan selama 5 - 10 menit sebelum tampil. Namun, jika hasil tes masih negatif biarkan berdiri dan amati tabung setelah 30 menit hingga 1 jam.

Munculnya warna merah muda-merah menunjukkan bahwa reaksi Voges-Proskauer positif. Jika mediumnya tetap kuning, reaksinya negatif.

Penambahan pengembang dalam urutan dan jumlah yang ditunjukkan sangat penting untuk menghindari negatif palsu.

Gunakan

Tes Voges-Proskauer berguna untuk membedakan antara strain E. coli yang negatif VP, dari genera Klebsiella, Enterobacter, Serratia, antara lain, yang positif VP.

Kontrol kualitas

Strain kontrol dapat digunakan untuk menguji kualitas medium yang disiapkan. Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Proteus mirabilis ATCC 43071, Salmonella typhimurium dan Enterobacter cloacae ATCC 13047.

Hasil yang diharapkan adalah reaksi Voges-Proskauer positif hanya untuk K. pneumoniae dan E. cloacae. Selebihnya memberikan reaksi negatif.

Referensi

  1. Laboratorium Britania. MR-VP Medium. 2015. Tersedia di: www.britanialab.com
  2. Laboratorium Microkit M-Ident Voges Proskauer. 2014. Tersedia: http://www.medioscultivo.com
  3. Mac Faddin J. (2003). Tes biokimia untuk identifikasi bakteri yang penting secara klinis. Edisi ke-3. Editorial Panamericana. Buenos Aires Argentina.
  4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnosis mikrobiologis Bailey & Scott. 12 ed. Editorial Panamericana S.A. Argentina.
  5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnosis mikrobiologis. Edisi ke-5. Editorial Panamericana S.A. Argentina.