Pengurutan DNA Maxam-Gilbert, metode Sanger, contoh



itu Pengurutan DNA (Asam deoksiribonukleat) adalah prosedur yang dilakukan di laboratorium biologi molekuler yang memungkinkan mengetahui urutan nukleotida dalam materi genetik yang menarik. Selain itu, pengurutan RNA (asam ribonukleat) juga dapat diungkapkan.

Teknik ini sangat diperlukan untuk pengembangan ilmu biologi. Ini juga berlaku untuk bidang pengetahuan lain - misalnya diagnosis medis dan investigasi forensik, misalnya.

Sebelumnya, pengurutan untai DNA dianggap sebagai aktivitas yang lambat dan mahal, yang memungkinkan identifikasi hanya beberapa pasangan basa dalam oligonukleotida..

Saat ini, dengan semua kemajuan ilmu pengetahuan, sekuensing DNA adalah operasi rutin di banyak laboratorium di seluruh dunia berkat kontribusi hampir 50 tahun penelitian di bidang ini. Sedangkan untuk panjang rantai, Anda dapat mengurutkan hingga jutaan pasangan basa dalam waktu yang sangat singkat.

Untuk melakukannya, ada puluhan teknik yang dikembangkan yang bervariasi dalam harga dan akurasi. Dalam artikel ini, kami akan menjelaskan teknik klasik dan modern, masing-masing dengan kelebihan dan kekurangannya.

Sejauh ini, teknik sekuensing memungkinkan untuk mendapatkan urutan genom lengkap, dari prokariota kecil dan ragi hingga genom manusia..

Indeks

  • 1 Struktur DNA
  • 2 Sejarah
  • 3 Metode Sanger
    • 3.1 Komponen utama dari reaksi
    • 3.2 Membaca hasilnya
  • 4 Urutan otomatis
  • 5 Maxam-Gilbert sequencing
    • 5.1 Prosedur
    • 5.2 Membaca hasilnya
  • 6 Urutan besar-besaran
    • 6.1 Pyrosequencing
    • 6.2 Urutan dengan sintesis
    • 6.3 Mengurutkan berdasarkan ligasi
    • 6.4 Sequencing Ion Torrent
  • 7 Contoh
    • 7.1 Urutan genom manusia
  • 8 Pentingnya dan aplikasi
  • 9 Referensi

Struktur DNA

Untuk memahami metode dan teknik yang digunakan untuk sekuensing DNA, perlu diketahui aspek-aspek kunci tertentu dari struktur dan komposisi molekul..

DNA adalah biomolekul yang ditemukan di semua makhluk hidup, dari bakteri hingga hewan air besar. Organel - seperti mitokondria dan kloroplas - memiliki molekul DNA melingkar di dalamnya. Bahkan pada beberapa virus, materi genetik yang ditemukan adalah DNA.

Secara struktural, DNA adalah seperangkat nukleotida. Masing-masing diintegrasikan oleh karbohidrat, basa nitrogen (A, T, C atau G) dan gugus fosfat. Tujuan dari sekuensing DNA adalah untuk mengungkapkan urutan di mana empat basa nitrogen ditemukan dalam urutan.

Sejarah

Pada pertengahan 1950-an, peneliti Watson dan Crick menggambarkan struktur DNA menggunakan teknik kristologis. Namun, tidak satu pun dari peneliti ini yang dapat menemukan cara untuk mengungkap urutan.

Meskipun ada pendahulu tertentu, peristiwa yang paling penting adalah penciptaan metode Sanger, pada tahun 1977. Frederick Sanger, bapak metode ini, adalah seorang ahli biokimia Inggris, pemenang dua hadiah Nobel atas kontribusinya yang sangat besar bagi ilmu biologi.

Teknik ini juga dikenal dalam literatur sebagai "pemutusan rantai" atau dideoxynucleotides. Selanjutnya kita akan menjelaskan prinsip-prinsip teknik ini dan yang dikembangkan berdasarkan peningkatan dan inovasi ini.

Metode Sanger

Pengembangan metode Sanger merupakan peristiwa penting dalam biologi molekuler. Ini melibatkan komponen dasar dari proses replikasi DNA yang biasanya terjadi dalam sel, tetapi dengan menambahkan komponen khusus: dideoxynucleotides.

Komponen utama dari reaksi

- DNA polimerase: enzim DNA polimerase adalah elemen penting dari proses. Molekul ini berpartisipasi dalam replikasi untai DNA dan perannya adalah sintesis rantai baru, mencocokkan deoksiribonukleotida trifosfat dengan yang saling melengkapi..

Ingat bahwa dalam DNA timin (T) dipasangkan dengan adenin (A) melalui dua ikatan hidrogen, sedangkan sitosin (C) bekerja dengan guanin (G) oleh tiga jembatan.

- Nukleotida: Sanger sequencing melibatkan dua jenis nukleotida, empat 2'-deoksinukleotida (disingkat dATP, dGTP, dCTP dan dTTP) dan empat dideoxynucleotides (ddATP, ddGTP, ddCTP dan ddTTP).

Meskipun dideoksinukleotida mirip dengan monomer yang biasanya dimasukkan ke dalam DNA, mereka tidak memiliki gugus -OH dalam strukturnya. Ini membuat mustahil untuk menambahkan nukleotida baru ke rantai.

Karena itu, ketika nukleotida khusus ditambahkan - dengan cara yang benar-benar acak - ke rantai dalam formasi, sintesisnya lumpuh. Dengan cara ini, pada akhir reaksi, ada rantai dengan ukuran berbeda, masing-masing di mana reaksi dihentikan pada titik yang berbeda..

Secara eksperimental, empat percobaan disiapkan. Masing-masing berisi DNA yang diekstraksi dari sampel biologis yang diminati, nukleotida normal dan satu dari empat jenis nukleotida khusus. Atau nukleotida khusus ditandai dengan beberapa jenis penanda fluoresens (lihat di bawah urutan otomatis).

Membaca hasilnya

Langkah pertama adalah memisahkan masing-masing rantai yang disintesis menurut ukurannya. Beberapa akan lebih panjang dari yang lain, tergantung di mana basis khusus dimasukkan.

Ada berbagai teknik biokimia yang memungkinkan pemisahan komponen campuran menggunakan ukuran sebagai sifat diskriminatif. Dalam metode Sanger, rantai yang berbeda dipisahkan oleh elektroforesis. Dalam varian teknik yang paling canggih, elektroforesis kapiler digunakan.

Dengan demikian, untaian yang lebih panjang bergerak kurang dari varian yang lebih pendek. Kemudian, sistem ini melewati pembaca yang mengenali penanda yang termasuk dalam setiap dideoxynucleotide. Dengan cara ini, urutan urutannya bisa diketahui.

Teknik "generasi pertama" ini mampu membaca fragmen DNA tidak lebih besar dari 1 kilobase. Saat ini, metode Sanger digunakan di beberapa laboratorium, umumnya dalam varian modern. Selain itu, digunakan untuk menguatkan hasil yang diperoleh dengan teknik paling kompleks - tetapi kurang tepat.

Sequencing otomatis

Ketika sekuensing skala besar diperlukan, proses dipercepat oleh otomatisasi. Ini adalah variasi dari metode terminasi rantai Sanger, di mana primer ditandai dengan produk fluoresen untuk membedakannya.

Selanjutnya, produk dari reaksi dijalankan dalam elektroforesis - semua dalam satu jalur. Ketika setiap fragmen meninggalkan bagian akhir gel, ia dengan cepat diidentifikasi oleh label fluoresennya, dengan kesalahan yang mengelilingi 1%.

Sistem yang paling canggih memiliki sistem hingga 96 tabung kapiler yang dioperasikan oleh komputer yang dipasangkan dengan robot. Artinya, 96 sampel DNA dapat dievaluasi secara bersamaan. Dengan demikian, proses yang melibatkan elektroforesis dan analisis hasilnya sepenuhnya otomatis.

Dalam satu hari, sistem ini dapat mengurutkan hingga 550.000 pangkalan. Selama proses itu, pekerjaan manusia tidak perlu, hanya butuh sekitar 15 menit untuk memulai metode ini.

Sequencing oleh Maxam-Gilbert

Pada saat yang sama ketika Sanger menerbitkan karyanya, dua peneliti bernama Allan Maxan dan Walter Gilbert berhasil mengembangkan metode lain untuk mendapatkan urutan DNA. Metode ini mendapatkan popularitas pada saat itu, tetapi kemudian digantikan oleh peningkatan metode Sanger.

Berlawanan dengan metode Sanger, sekuensing Maxan dan Gilbert (atau sekuensing kimia, seperti juga diketahui) tidak melibatkan reaksi hibridisasi. Metodologi ini terdiri dari penandaan dengan agen reaktif di satu ujung, diikuti oleh proses pemurnian.

Salah satu aspek negatif dari teknik ini terletak pada kompleksitasnya yang sangat besar dan dalam penggunaan bahan kimia yang berbahaya bagi pengguna. Kerusakan kimia disebabkan oleh penerapan DMS, asam format, hidrazin dan hidrazin dengan garam.

Prosedur

Protokol dimulai dengan pelabelan pada ujung 5 'dari untai dengan penanda fosfor 32, kemudian modifikasi kimiawi dari basa nitrogen terjadi dan dipisahkan. Akhirnya pemisahan wilayah abasic terjadi.

Pertama rantai yang akan diurutkan disingkat menjadi segmen yang lebih kecil. Langkah ini dilakukan dengan enzim restriksi, yang menghasilkan ekstrem yang luar biasa.

Selanjutnya, reaksi dilakukan dengan alkali fosfatase, yang tujuannya adalah untuk menghilangkan gugus fosfat. Jadi, polinukleotida kinase dapat digunakan untuk melakukan pelabelan.

Rantai didenaturasi (dua untaian terbuka). Kemudian kami melanjutkan untuk menerapkan bahan kimia. Reaksi pembelahan ini dilakukan secara terkendali dan jenis ikatan apa yang dipatahkan oleh masing-masing bahan kimia yang diterapkan.

Membaca hasilnya

Seperti dalam metode Sanger, pembacaan hasil melibatkan pemisahan dengan ukuran rantai yang diperoleh dalam sistem elektroforesis. Sistem yang tersusun dari poliakrilamida memungkinkan untuk mendapatkan resolusi yang sangat memadai untuk membaca gel.

Urutan besar-besaran

Sequencing masif mencakup serangkaian metode baru, disingkat NGS, dari bahasa Inggris "Sequencing Generasi Selanjutnya ".

Metode yang dikatalogkan sebagai NGS memerlukan langkah amplifikasi DNA sebelumnya (mereka tidak bekerja dengan molekul tunggal). Selain itu, platform yang digunakan sangat bervariasi. Prinsip-prinsip metode paling populer akan dijelaskan di bawah ini:

Pyrosequencing

Ini melibatkan pemantauan pelepasan pirofosfat, yang terjadi setiap kali nukleotida baru ditambahkan ke untai DNA. Sistem enzim digabungkan, sehingga emisi cahaya (yang dapat dideteksi oleh kamera) terjadi setiap kali nukleotida baru dimasukkan.

Proses dimulai dengan inkubasi terpisah dari setiap basa nitrogen untuk memverifikasi apakah ada emisi cahaya atau tidak. Pyrosequencing dapat melakukan pembacaan untaian panjang, tetapi tingkat kesalahan yang ditemukan tinggi.

Sequencing dengan sintesis

Ini melibatkan penggabungan nukleotida berlabel. Komponen-komponen fluoresen ini ditambahkan, dicuci, dan nukleotida yang tergabung dicatat. Kemudian, pelabelan nukleotida dihilangkan, dan sintesis untai dapat berlanjut. Pada langkah berikutnya, nukleotida berlabel juga akan dimasukkan, dan langkah-langkah yang disebutkan akan diulang.

Satu kelemahan dengan teknik ini terjadi ketika penanda fluorescent tidak sepenuhnya dihilangkan. Emisi ini menciptakan kesalahan latar belakang, menghasilkan kesalahan signifikan.

Sequencing oleh ligasi

Teknik ini bervariasi dari yang lain, karena tidak menggunakan DNA polimerase. Sebaliknya, enzim utama untuk metodologi ini adalah ligase. Di sini digunakan fragmen-fragmen DNA berlabel fluoresensi, diikat oleh enzim dan dideteksi.

Masalah terbesar dengan teknik ini adalah panjang fragmen yang sangat pendek yang mampu diproses.

Ion Sequencing Torrent

Teknik ini didasarkan pada pengukuran ion H+ yang dilepaskan setiap kali nukleotida baru dimasukkan. Prinsipnya sangat mirip dengan pyrosequencing, tetapi jauh lebih murah.

Contohnya

Urutan genom manusia

Mengurutkan genom manusia telah menjadi salah satu tantangan paling menjanjikan dalam biologi, serta menjadi salah satu persaingan yang paling diakui dalam sejarah ilmu pengetahuan. Bahkan, bagi para ilmuwan yang terlibat dalam proyek tersebut, pengurutan genom menjadi kompetisi.

Pada 1990 ia memulai apa yang disebut "proyek genom manusia", dipimpin oleh ilmuwan terkenal, pemenang Hadiah Nobel, James Watson. Setelah satu tahun, pada tahun 1991, Venter mengambil tantangan untuk "mengalahkan" Watson dan mengurutkan genom di depannya. Namun, pada tahun 1992, Watson pensiun dan perintah itu diambil oleh peneliti lain.

Pada 1995 Venter mengumumkan keberhasilannya dalam sekuensing lengkap genom bakteri dengan metode sekuensing acak. Demikian pula, tim lawan mengumumkan setahun kemudian pengurutan genom ragi.

Pada tahun 2000 perlombaan dihentikan. Kedua perusahaan menerbitkan hasil awal mereka dari genom lengkap dalam dua jurnal paling bergengsi dalam sains: Alam dan Sains.

Namun, para ilmuwan terus bekerja untuk memperbaiki proposal, dan pada tahun 2006 urutannya diselesaikan kromosom manusia tertentu.

Pentingnya dan aplikasi

Mengetahui urutan nukleotida molekul sama pentingnya dengan DNA sangat berharga bagi ahli biologi dan profesional terkait. Rantai polinukleotida ini mengandung semua informasi yang diperlukan untuk pengembangan dan pemeliharaan semua bentuk kehidupan.

Untuk alasan ini, pengetahuan tentang urutan ini sangat penting untuk penelitian biologi. Pada dasarnya, pengurutan memungkinkan kita untuk mengukur salah satu sifat terpenting dari sistem biologis dan untuk membuat perbedaan di antara mereka.

Sekuensing banyak digunakan oleh ahli taksonomi dan ahli sistematika, karena sekuens DNA tertentu memungkinkan penetapan kriteria untuk menyimpulkan apakah dua organisme termasuk spesies yang sama atau tidak, serta mampu mengajukan hipotesis tentang hubungan filogenetik di antara mereka..

Selain itu, pengurutan DNA memiliki aplikasi di bidang kedokteran dan diagnostik. Sebagai contoh, ada sistem yang terjangkau dan dapat diakses yang, melalui pengurutan, memungkinkan kami untuk mengevaluasi kecenderungan untuk mengembangkan penyakit tertentu (seperti kanker) menggunakan apa yang disebut simple nucleotide polymorphisms (SNP)..

Penyelidikan jenis kriminal dan forensik juga telah diperkaya dengan teknik sequencing, dan dapat digunakan sebagai bukti yang dapat diandalkan dari partisipasi individu tertentu dalam kejahatan.

Referensi

  1. Heather, J. M., & Chain, B. (2016). Urutan sequencer: sejarah sequencing DNA. Genomik, 107(1), 1-8.
  2. Koboldt, D.C., Steinberg, K.M., Larson, D.E., Wilson, R.K, & Mardis, E.R. (2013). Generasi berikutnya dari revolusi pengurutan dan pengaruhnya terhadap genomik. Sel, 155(1), 27-38.
  3. Levy, J. (2010). Persaingan ilmiah. Dari Galileo ke proyek genom manusia. Editorial Paraninfo.
  4. Sanger, F., Nicklen, S., & Coulson, A. R. (1977). Sekuensing DNA dengan inhibitor pemutusan rantai. Prosiding akademi ilmu pengetahuan nasional, 74(12), 5463-5467.
  5. Schuster, S. C. (2007). Sequencing generasi berikutnya mengubah biologi saat ini. Metode alam, 5(1), 16.
  6. Xu, J. (Ed.). (2014). Sequencing generasi berikutnya. Caister Academic Press.