Karakteristik Proteinase K, aktivitas dan aplikasi enzimatik



itu proteinase K adalah enzim yang termasuk dalam kelompok serin protease, yaitu, ia memiliki pusat katalitik aktifnya serin asam amino dan memiliki fungsi memutus ikatan peptida dengan hidrolisis. Pada gilirannya, enzim ini milik keluarga protein subtilisin (peptidase S8).

Proteinase K memiliki berat molekul (MW) 28.900 dalton dan diisolasi untuk pertama kali pada tahun 1974 dari ekstrak jamur. Album Engyodontium, sebelumnya dikenal dengan nama Album Tritirachium Limber.

Ini menyajikan kapasitas proteolitik yang tinggi, terbukti mampu mendegradasi keratin yang ada di rambut. Kata keratin dalam bahasa Inggris ditulis "keratin", oleh karena itu ia disebut "proteinase K".

Karena kapasitasnya yang tinggi untuk membelah protein asli, enzim ini berguna dalam berbagai teknik biologi molekuler. Ini terutama digunakan untuk mengisolasi dan menyiapkan asam nukleat dengan berat molekul tinggi (MW).

Proteinase K bertindak dengan melepaskan DNA nuklir, sambil menghancurkan protein dan menonaktifkan RNase dan DNases, yaitu, menghilangkan nuklease dalam persiapan DNA dan RNA..

Di sisi lain, telah terlihat bahwa proteinase K dapat menghidrolisis beberapa protein asli terdenaturasi, yang telah membangkitkan minat para peneliti untuk digunakan dalam studi protein prion (PrPC).

Namun, meskipun memiliki potensi proteolitik yang tinggi, ada protein yang resisten terhadap aksi proteinase K. Di antaranya, ada beberapa protein abnormal yang disebut prion (PrPSc), yang terkait dengan ensefalopati spongiform yang dapat menular..

Indeks

  • 1 Karakteristik proteinase K
  • 2 Aktivitas enzimatik
  • 3 Aplikasi
  • 4 Keuntungan proteinase K
  • 5 Protein yang tahan protein K
  • 6 Referensi

Karakteristik proteinase K

Proteinase K memiliki struktur tersier yang dibentuk oleh tiga lapisan, dengan selembar β tujuh rantai diselingi antara dua lapisan heliks. Karena itu milik keluarga peptidase S8, ia ditandai dengan memiliki triad katalitik di situs aktifnya, yang urutan berurutannya adalah (Asp, His dan Ser), yang membedakannya dari keluarga peptidase lain..

Enzim ini dari kelompok protease serin ditandai dengan menghidrolisis ikatan peptida yang dekat dengan gugus karboksilat dari asam amino alifatik dan aromatik..

Selain itu, mampu bertindak di hadapan tertentu korosif, seperti natrium dodesil sulfat (SDS), Tris-HCL dan EDTA, yang digunakan untuk membantu denaturasi protein, menyebabkan mereka kehilangan zat struktur asli mereka.

Ini adalah langkah awal dalam persiapan protein untuk teknik elektroforesis. Kisaran pH di mana proteinase K bekerja cukup luas (2,0 hingga 12,0), dengan pH optimal antara 7,5 hingga 12,0, dan titik isoelektriknya adalah 8,9. Seperti yang dapat diamati, ini aktif terhadap kisaran pH yang sangat luas.

Karakteristik lain yang menonjol dalam proteinase K adalah kestabilannya di hadapan suhu tinggi (50 - 60 ° C).

Aktivitas enzimatik

Proteinase K membutuhkan kehadiran ion kalsium, meskipun ini tidak mempengaruhi aktivitasnya, jika itu penting untuk menjaga stabilitasnya.

Agar proteinase K melakukan pencernaan lengkap dari substrat, diperlukan waktu kontak antara 5 menit dan 2 jam..

Namun, dalam hal ini Daza dkk. Membandingkan kemurnian DNA yang diperoleh pada beberapa kali paparan proteinase K, dan menyimpulkan bahwa inkubasi yang berkepanjangan (hingga 24 jam) secara signifikan meningkatkan kualitas DNA.

Sekarang, sehubungan dengan konsentrasi yang digunakan dari enzim proteinase K dalam protokol yang berbeda, dapat dikatakan bahwa itu sangat bervariasi.

Ini dapat digunakan dari konsentrasi yang sangat rendah (5 μg / ml) hingga konsentrasi 500 μg / ml. Tetapi konsentrasi kerja yang paling sering berkisar antara 50-100μg / ml, terutama untuk pencernaan protein dan inaktivasi nuklease. Meskipun konsentrasi 2 mg / ml diperlukan untuk perawatan jaringan.

Aplikasi

Aplikasinya sangat luas dan dapat diringkas sebagai berikut:

-Hal ini digunakan dalam pencernaan protein dan metode ekstraksi DNA sebagai beberapa: salting-out, PK-SDS, setiltrimetilamonium bromida amonium bromida (CTAB), dan kalium asetat dimodifikasi ekstraksi dengan natrium iodida.

-Inaktivasi nuklease (RNases dan DNases).

-Dalam teknik hibridisasi di situ (HIS), untuk membantu melepaskan asam nukleat, selain menghilangkan protein yang tidak diinginkan.

-Modifikasi protein.

-Di tingkat penelitian, dalam berbagai penelitian.

Keuntungan proteinase K

Beberapa studi perbandingan telah dilakukan antara teknik ekstraksi DNA menggunakan Proteinase K, dengan yang lain yang tidak menggunakannya dan semua menyimpulkan bahwa ada manfaat yang lebih besar ketika menggunakan enzim. Di antara kelebihannya, berikut ini bisa disebutkan:

-DNA dengan berat molekul tinggi dengan kualitas dan kemurnian tinggi diperoleh.

-DNA yang diekstraksi stabil hingga 3 bulan.

DNA yang diekstraksi dapat digunakan dalam teknik-teknik berikut: Southern blot, polymerase chain reaction (PCR), elektroforesis, antara lain.

Protein resisten terhadap proteinase K

Berbagai penyelidikan telah menyimpulkan bahwa prion (protein beracun PrPSc abnormal) dibedakan dari protein PrPC (asli) karena mereka resisten terhadap aksi proteinase K, sedangkan PrPC sensitif terhadap tindakan mereka..

Penulis lain telah menggambarkan bahwa dalam struktur PrPSc ada bagian sensitif dan lainnya resisten terhadap proteinase K. Namun, kedua bagian sama-sama beracun dan infektif..

Di sisi lain, Bastian dan kolaborator pada tahun 1987 mengisolasi 4 protein dari 28, 30, 66 dan 76 kda dari spesies Spiroplasma mirum. Semua resisten terhadap aksi proteinase K dan juga memiliki reaksi silang dengan beberapa prion.

Diketahui bahwa spesies ini dapat menyebabkan katarak dan kerusakan neurologis yang penting dan karena temuan ilmiah Bastian, di antara penyelidikan lainnya, upaya telah dilakukan untuk menghubungkan mikroorganisme ini dengan ensefalopati spongiform yang dapat ditularkan..

Namun, etiologi patologi neurologis degeneratif ini masih dikaitkan dengan prion saat ini.

Dalam hal ini, Butler dan kolaborator pada tahun 1991 mengidentifikasi dan mengkarakterisasi kelas K protein protein resisten 40 Kda dari dua strain Mycoplasma hyorhinis. Patogen ini mempengaruhi babi, menginfeksi jaringan mereka, tetapi dalam kasus ini tidak ada reaksi silang dengan prion yang diuji.

Diperlukan lebih banyak penelitian untuk menjelaskan banyak hal yang tidak diketahui tentangnya.

Referensi

  1. Bastian F, Jennings R, dan Gardner W. 1987. Antiserum terhadap scrapie terkait protein fibril bereaksi silang dengan Spiroplasma mirum protein fibril. J. Clin. Mikrobiol. 25: 2430-2431.
  2. Daza C, Guillen J, King J, Ruiz V. Evaluasi metode ekstraksi dan pemurnian DNA dari jaringan otot yang difiksasi dalam formaldehyde dari mayat yang tidak dikenal.  Majalah Med, 2014; 22 (1): 42-49,
  3. Butler G, Kotani H, Kong L, Frick M, Evancho S, Stanbridge E, dan Mcgarrity G. Identifikasi dan Karakterisasi Protein K-Resistant Protein pada Anggota Kelas Mollicutes. Infection and Immunity, 1991, 59 (3): 1037-1042
  4. López M, Rivera M, Viettri M, Lares M, Morocoima A, Herrera L, dkk. Perbandingan dua protokol untuk mengekstraksi DNA dari Trypanosoma cruzi tumbuh di media aksenic. Pdt. Peru. Med Exp. Kesehatan Masyarakat  2014; 31 (2): 222-227. Tersedia di: scielo.org
  5. Jiménez G, Villalobos M, Jiménez E dan Palma W. Penentuan efektivitas lima protokol ekstraksi DNA dari bahan parafin untuk studi molekuler. Rev Méd Kosta Rika. 2007; 1 (1): 10-19.