Pondasi, persiapan dan penggunaan kaldu urea



itu urea broth adalah media kultur cair, yang digunakan untuk menunjukkan keberadaan enzim urease dalam mikroorganisme tertentu. Urease adalah enzim mikroba yang diproduksi secara konstitutif, yaitu, disintesis secara independen dari apakah substrat bertindak atau tidak..

Fungsi urease terkait dengan dekomposisi senyawa organik. Tidak semua mikroorganisme dapat mensintesis enzim ini, oleh karena itu tekadnya di laboratorium memungkinkan mengidentifikasi jenis bakteri tertentu dan bahkan membedakan antara spesies dari genus yang sama..

Ada dua jenis tes urea: Stuart dan Christensen. Mereka berbeda dalam komposisi dan sensitivitas. Yang pertama adalah khusus untuk menunjukkan sejumlah besar urease yang diproduksi oleh spesies dari genus Proteus.

Yang kedua lebih sensitif dan dapat mendeteksi sejumlah kecil urease yang dihasilkan terlambat oleh genera bakteri lain, seperti Klebsiella, Enterobacter, Staphylococcus, Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus, Helicobacter dan Mycobacterium.

Stuart urea broth terdiri dari urea, natrium klorida, dipotassium fosfat, monopotassium fosfat, ekstrak ragi, fenol merah dan air suling.

Sedangkan kaldu Christensen atau agar urea terdiri dari pepton, natrium klorida, monopotassium fosfat, glukosa, urea, fenol merah, air suling dan agar-agar. Yang terakhir hanya jika itu adalah media padat.

Indeks

  • 1 Yayasan
    • 1.1 kaldu urea Stuart
    • 1.2 Christensen broth atau agar urea
    • 1.3 Interpretasi dari kedua media (Stuart dan Christensen)
  • 2 Persiapan
    • 2.1 kaldu urea Stuart
    • 2.2 Christensen broth atau agar urea
  • 3 Penggunaan
  • 4 Menabur tes urea
  • 5 Kontrol kualitas
  • 6 Referensi

Yayasan

Enzim urease menghidrolisis urea untuk membentuk karbon dioksida, air dan dua molekul amonia. Senyawa-senyawa ini bereaksi untuk membentuk produk akhir yang disebut amonium karbonat.

Stuart urea broth

Kaldu urea Stuart lebih buffer dengan pH 6,8. Oleh karena itu, mikroorganisme harus mampu membentuk sejumlah besar amonium untuk menjadi merah menjadi fenol. PH harus naik di atas 8.

Oleh karena itu kaldu urea Stuart selektif untuk spesies Proteus, memberikan hasil positif dalam 24 hingga 48 jam inkubasi, dan tidak efektif untuk bakteri yang menghasilkan urease dalam jumlah rendah atau yang perlahan menghidrolisis urea.

Ini karena spesies Proteus dapat menggunakan urea sebagai sumber nitrogen. Sebaliknya, bakteri penghasil urease lain membutuhkan sumber tambahan.

Namun, Pérez et al. (2002) menetapkan bahwa kaldu urea Stuart seefisien urea agar dari Christensen, untuk menentukan urease dalam strain ragi dari genera Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Trichosporon dan Saccharomyces..

Para penulis penelitian mengklaim telah mencapai 100% kebetulan dengan kedua media (Stuart dan Christensen) dengan menginkubasi selama 24 dan 48 jam; membuat ketentuan bahwa mereka menganggap sama positifnya strain yang berhasil mengubah media menjadi warna pink-fuchsia yang kuat.

Klarifikasi ini diperlukan, karena Lodder (1970) menegaskan bahwa hampir semua ragi berhasil menempatkan bevel urea agar Christensen menjadi merah muda pucat. Ini karena mereka dapat menghidrolisis urea dalam jumlah minimal, dan untuk pembentukan amina oleh dekarboksilasi oksidatif dari asam amino di permukaan. Ini tidak boleh ditafsirkan sebagai positif.

Kaldu atau agar urea dari Christensen

Christensen urea broth atau agar kurang buffer, mampu mendeteksi sejumlah kecil amonium. Selain itu, media ini diperkaya dengan pepton dan glukosa. Senyawa ini menyebabkan mikroorganisme penghasil urease lain yang tidak tumbuh dalam kaldu Stuart untuk berkembang.

Demikian juga, tes Christensen urea menawarkan hasil yang lebih cepat, terutama untuk Proteus, mampu memberikan sangat positif dalam waktu minimum 30 menit sebagai waktu minimum dan hingga 6 jam sebagai waktu maksimum.

Sisa dari mikroorganisme penghasil urease berhasil mengubah warna medium sedikit setelah 6 jam, dan sangat setelah 24, 48, 72 jam atau lebih, dan bahkan beberapa strain dapat memberikan reaksi lemah setelah 5 atau 6 hari.

Interpretasi dari kedua media (Stuart dan Christensen)

Media awalnya berwarna kuning-oranye dan reaksi positif akan mengubah warna medium menjadi pink-fuchsia. Intensitas warna berbanding lurus dengan jumlah amonium yang dihasilkan.

Reaksi negatif akan meninggalkan media warna asli kecuali untuk ragi, yang dapat memberikan warna merah muda pucat dengan Christensen urea agar.

Persiapan

Stuart urea broth

Timbang gram yang diperlukan sesuai dengan indikasi rumah komersial. Larutkan dalam air suling yang steril. Jangan gunakan panas untuk larut, karena urea sensitif terhadap panas.

Metode filtrasi membran digunakan untuk mensterilkan. Untuk ini, filter Millipore dengan pori-pori berdiameter 0,45 μ digunakan. Jangan gunakan autoclave. Setelah larutan disaring, larutan didistribusikan dalam tabung steril. Untuk mendapatkan hasil yang andal, harus ditransfer antara 1,5 ml sebagai jumlah minimum hingga 3 ml sebagai jumlah maksimum per tabung..

Simpan dalam lemari es dan temperamen sebelum digunakan.

Jika metode filtrasi tidak tersedia, media harus segera digunakan untuk mendapatkan hasil yang andal.

Cara lain untuk menyiapkan kaldu urea Stuart adalah sebagai berikut:

Beberapa rumah komersial menjual setengah pangkalan untuk tes urea, tidak termasuk urea.

Jumlah yang ditunjukkan oleh rumah komersial ditimbang. Ini dilarutkan dalam air suling dan disterilkan dalam autoklaf pada 121 ° C selama 15 menit. Biarkan sedikit istirahat dan ketika sedang hangat tambahkan 100 ml larutan urea disiapkan pada 20% dan disterilkan dengan filtrasi.

Ini didistribusikan dalam tabung steril, seperti yang dijelaskan sebelumnya.

Kaldu atau agar urea dari Christensen

-Persiapan solusi urea

Timbang 29 gram urea dehidrasi dan larutkan dalam 100 ml air suling. Gunakan metode filtrasi untuk mensterilkan. Jangan autoklaf.

-Agar dasar urea

Larutkan 24 g agar-agar basa dehidrasi dalam 950 ml air suling. Sterilkan dalam autoklaf pada 121 ° C selama 15 menit. Diamkan hingga mencapai suhu 50 ° C dan tambahkan urea yang sebelumnya disiapkan secara aseptik.

Tuang 4 hingga 5 ml ke dalam tabung steril dan miringkan hingga padat. Harus ada puncak seruling yang panjang.

Media ini juga bisa dibuat dalam bentuk cair.

Penggunaan

Tes urea sangat efektif dalam membedakan genus Proteus dari genera lain dari Keluarga Enterobacteriaceae, mengingat reaksi cepat yang diberikan oleh Proteus.

Jika komposisi Christensen digunakan, tes ini membantu membedakan antara spesies dari genus yang sama. Sebagai contoh, S. haemolyticus dan S. warneri spada Staphylococcus koagulase negatif dan betahemolitik, tetapi mereka berbeda dalam hal itu S. haemolyticus itu adalah urea negatif dan S. warneri itu adalah urea positif.

Di sisi lain, McNulty berhasil menggunakan 2% kaldu urea Christensen untuk mempelajari keberadaan Helicobacter pylori dalam sampel biopsi yang diambil dari mukosa lambung (daerah antral).

Kehadiran H. pylori itu dibuktikan dengan tes urea positif. Durasi untuk mengamati hasil berbanding lurus dengan jumlah mikroorganisme yang ada.

Seperti dapat dilihat, ini adalah metode sederhana untuk diagnosis Helicobacter pylori dalam biopsi lambung.

Akhirnya, tes ini juga berguna untuk membedakan spesies dari genera Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus dan Mycobacteria.

Menabur tes urea

Kedua metode ini membutuhkan inokulum mikroba yang kuat untuk mengoptimalkan hasil. Koloni bakteri lebih disukai diambil dari agar darah dan ragi agar Sabouraud, dengan beberapa pengecualian. Inokulum diemulsi dalam media cair.

Untuk kaldu urea Stuart diinkubasi pada suhu 37 ° C selama 24 hingga 48 jam, mengetahui bahwa seseorang hanya mencari strain dari genus Proteus ketika strainnya adalah bakteri. Untuk ragi dapat diinkubasi pada suhu 37 ° C atau pada suhu kamar selama 24 hingga 48 jam inkubasi.

Dalam kasus kaldu Christensen urea, inkubasi pada suhu 37 ° C selama 24 jam. Jika tes negatif, itu dapat diinkubasi hingga 6 hari. Jika tes positif sebelum 6 jam, ini menunjukkan bahwa itu adalah strain dari genus Proteus.

Dalam kasus agar Christensen urea, bevel agar sangat diinokulasi, tanpa menusuk. Kaldu diinkubasi dan ditafsirkan dengan cara yang sama.

Kontrol kualitas

Strain kontrol dapat digunakan untuk menguji medium, seperti Proteus mirabilis ATCC 43071, Klebsiella pneumoniae  ATCC 7006003, Escherichia coli ATCC 25922 dan Salmonella typhimurium.  Dua yang pertama harus memberikan hasil positif dan dua hasil negatif yang terakhir.

Referensi

  1. Pérez C, Goitía K., Mata S, Hartung C, Colella M, Reyes H. et al. Penggunaan kaldu urea Stuart untuk tes urease, sebagai tes dalam diagnosis ragi. Pendeta Soc. Ven. Mikrobiol. 2002; 22 (2): 136-140. Tersedia di: Scielo.org.
  2. Mac Faddin J. (2003). Tes biokimia untuk identifikasi bakteri yang penting secara klinis. Edisi ke-3. Editorial Panamericana. Buenos Aires Argentina.
  3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnosis mikrobiologis Bailey & Scott. 12 ed. Editorial Panamericana S.A. Argentina.
  4. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnosis mikrobiologis. Edisi ke-5. Editorial Panamericana S.A. Argentina.
  5. Laboratorium Britania. Christensen Medio (basis agar Urea) 2015. Tersedia di: britanialab.com