Karakteristik dan sediaan apus bakteri



itu apusan bakteri adalah perpanjangan dalam bentuk film tipis dari suspensi mikroorganisme bakteri yang dilakukan pada piring kaca transparan atau slide, untuk pengamatan di bawah mikroskop optik.

Perpanjangan dalam bentuk film dilakukan untuk memisahkan mikroorganisme sebanyak mungkin, karena jika mereka dikelompokkan pengamatan tidak jelas.

Dalam studi teknik kultur bakteri persiapan apusan, fiksasi dan pewarnaan digunakan untuk menganalisisnya dengan lebih baik. Karena ukuran kecil dari mikroorganisme, penggunaan mikroskop optik diperlukan untuk pengamatannya.

Mikroskop optik adalah instrumen yang sangat diperlukan untuk pengamatan noda. Ini menggunakan lensa dan cahaya optik yang memungkinkan visualisasi sampel dengan peningkatan besar dalam ukuran.

Secara umum, sel-sel hidup tidak memiliki struktur yang sebagian besar berwarna, terlihat melalui mikroskop optik mereka tidak berwarna, sampel transparan, dan menunjukkan sangat sedikit kontras internal dan dengan lingkungannya..

Pengamatan dengan mikroskop lapangan cahaya sederhana, tanpa menggunakan teknik pewarnaan tambahan, sangat terbatas dan hanya digunakan dalam beberapa kasus, seperti dalam pengamatan pergerakan mikroorganisme..

Untuk mengamati mikroorganisme secara optimal, keseimbangan antara kontras dan resolusi harus dicapai. Detail sel tidak dapat diamati di bawah mikroskop, bahkan pada resolusi tinggi; penggunaan pewarna diperlukan melalui teknik pewarnaan, yang memberikan kontras untuk pengamatan.

Indeks

  • 1 Karakteristik hapusan bakteri yang berkualitas baik
    • 1.1 Kontras yang luar biasa
    • 1.2 Perbaikan yang baik
    • 1.3 Pewarnaan yang bagus
  • 2 Persiapan
    • 2.1 A. Frotis
    • 2.2 B. Fiksasi
    • 2.3 C. Pewarnaan sederhana
    • 2.4 D. Pelestarian apusan apus secara definitif
  • 3 Referensi

Karakteristik apusan bakteri berkualitas baik

Kontras luar biasa

Untuk mencapai kontras yang sangat baik ada mikroskop canggih yang disebut mikroskop kontras fase, interferensi diferensial, dan mikroskop medan gelap. Jenis mikroskop ini digunakan untuk mengamati struktur bakteri seperti selubung dan filamen, antara lain.

Pewarnaan adalah teknik sederhana untuk meningkatkan kontras yang dicapai dengan mikroskop lapangan yang jelas. Dalam teknik ini, pewarna yang berbeda dapat digunakan yang secara nyata meningkatkan pengamatan di bawah mikroskop.

Noda dibuat langsung pada apusan atau ekstensi dari suspensi mikroorganisme pada slide, yang sebelumnya dikeringkan dan diperbaiki..

Perbaikan yang bagus

Fiksasi adalah teknik yang digunakan untuk melindungi struktur seluler; menyebabkan inaktivasi mikroorganisme dan adhesi pada kaca slide. Ada beberapa perawatan fiksasi yang berbeda: fiksasi panas dan fiksasi kimia.

Fiksasi panas

Ini adalah metode yang paling banyak digunakan dalam pengamatan noda bakteri. Teknik ini terdiri dari melewatkan suspensi bakteri pada apusan dengan nyala api yang lebih ringan. Teknik ini mampu melestarikan morfologi eksternal bakteri, tetapi menghancurkan struktur internalnya.

Fiksasi kimia

Fiksasi kimia menggunakan bahan kimia dalam pengawetan, seperti formaldehida atau formaldehida, etanol dan asam asetat, antara lain. Keuntungan menggunakan bahan pengikat bahan kimia adalah pelestarian struktur seluler internal mikroorganisme tercapai.

Noda yang bagus

Prosedur yang paling umum untuk pewarnaan noda kering sebelumnya dan tetap adalah pewarnaan positif atau sederhana, pewarnaan diferensial dan pewarnaan negatif. Ada juga teknik khusus untuk pewarnaan struktur sel tertentu (kapsul, spora, flagela).

Pewarnaan positif atau pewarnaan sederhana

Pewarnaan positif atau sederhana adalah teknik pewarnaan noda yang paling sering digunakan. Menggunakan pewarna yang memiliki kemampuan mengikat struktur mikroba tertentu, memungkinkannya untuk diamati di bawah mikroskop.

Pewarna ini memiliki gugus kromoforik (bagian berwarna) dalam struktur kimianya, dengan ikatan rangkap bolak-balik dan ikatan sederhana (konjugasi). Ikatan ini pada gilirannya dapat membentuk ikatan ionik atau kovalen dengan beberapa struktur seluler.

Pewarna yang digunakan dalam pewarnaan positif atau sederhana sebagian besar adalah turunan kimia dari anilin (garam organik berwarna).

Di sisi lain, di antara pewarna kita dapat menemukan beberapa dengan pH basa dan lainnya dengan pH asam.

Pewarna dasar

Pada pewarna dasar, gugus kromofor memiliki muatan listrik positif. Sebagian besar mikroorganisme prokariotik memiliki pH internal yang netral, dan permukaan selnya bermuatan negatif. Melalui interaksi elektrostatik ini, kromofor berikatan dengan sel dan mengecatnya.

Contoh pewarna dasar adalah metilen biru, kristal violet, hijau perunggu, fuscin dasar, safranin, dan lainnya..

Pewarna asam

Dalam pewarna asam, gugus kromofor memiliki muatan listrik negatif. Ini digunakan untuk pewarnaan protein dengan gugus amino bermuatan positif. Contoh-contoh pewarna asam adalah acid fuscin, rose Bengal, Congo red dan eosin.

Pewarnaan diferensial

Teknik pewarnaan diferensial terdiri dari penerapan dua pewarna dengan warna atau intensitas berbeda, untuk membedakan mikroorganisme yang berbeda di bawah mikroskop. Pewarnaan Gram dan pewarnaan tahan asam-alkohol adalah pewarnaan diferensial yang paling banyak digunakan dalam bakteriologi.

Pewarnaan Gram digunakan sebagai tes awal untuk mengetahui bentuk, ukuran, pengelompokan sel, selain jenis dinding sel. Melalui tes pewarnaan Gram, bakteri dengan dinding sel diklasifikasikan sebagai bakteri Gram-positif dan bakteri Gram-negatif.

Pewarnaan negatif

Dalam teknik ini pewarna kimia digunakan yang tidak menembus bagian dalam seluler, tetapi pewarna yang digunakan adalah medium di mana mikroorganisme muncul sebagai latar belakang hitam..

Dalam teknik pewarnaan negatif, apusan dibuat dengan setetes suspensi tinta Cina atau nigrosin, yang setelah memungkinkan pengeringan pada suhu kamar membentuk film buram ke bagian cahaya. Dengan cara ini, mikroorganisme diamati sebagai bentuk cerah pada latar belakang yang gelap.

Persiapan

A. Pulas

1.- Cuci slide dengan sangat baik, keringkan dengan kertas penyerap dan beri label. Label harus menunjukkan konten persiapan, tanggal, dan nama orang yang memprosesnya.

2.- Nyalakan korek api dan sterilkan loop inokulasi dalam nyala api sampai merah panas.

3.- Biarkan gagangnya dingin.

4.- Ambil tabung kultur bakteri, lepaskan tutupnya dan cepat-cepat melewati mulut tabung di dekat nyala api yang lebih terang (nyala api).

5.- Kenalkan loop inokulasi di dalam tabung yang berisi kultur bakteri dan ambil sampelnya.

6.- Jika kultur berada dalam media cair, tempatkan sampel yang diambil dengan pegangan di tengah slide dan sebarkan dengan hati-hati dalam sebuah lingkaran dengan diameter sekitar 2 cm.

7.- Sterilkan kembali loop inokulasi.

8.- Biarkan pengeringan apusan di udara.

9.- Ulangi langkah 3 hingga 8 tiga kali.

10.- Jika biakan berada dalam media padat, setetes air suling sebelumnya harus ditempatkan pada slide. Hal ini dilakukan untuk mencampur sampel kecil dari biakan yang diambil dengan pegangan inokulasi, sesuai dengan indikasi langkah 2 hingga 5 (kondisi asepsis).

11.- Perpanjang sampel yang diencerkan dengan tetesan air pada slide dan ulangi tiga kali.

B. Fiksasi

1.- Tambahkan ke apusan kering - diproduksi dari kultur dalam medium cair-, dua tetes metanol atau etanol absolut.

2.- Biarkan pengeringan di udara jauh dari pemantik.

3.- Jika apusan berasal dari kultur dalam medium padat, apusan kering difiksasi dengan panas, melewatkannya 2 hingga 3 kali dengan cepat melalui area terpanas nyala api korek api..

4.- Sentuh bagian bawah noda dengan bagian punggung tangan kiri (untuk tangan kanan, jika tidak gunakan tangan kanan) dan periksa apakah sudah dingin.

C. Pewarnaan sederhana

1.- Tambahkan 2 tetes pewarna yang dipilih ke apusan dan biarkan bertindak sesuai waktu yang diperlukan dalam protokol khusus masing-masing pewarna (biasanya antara 1 dan 5 menit).

2.- Beberapa pewarna memerlukan penggunaan panas untuk aktivasi mereka, dalam hal ini perlu sangat berhati-hati saat memanaskan slide dalam nyala api dari pemantik (memanipulasi dengan pinset dan menghindari mendidih). Terlalu panas dari noda dapat merusak sel-sel yang ingin Anda amati.

3.- Hapus kelebihan pewarna dengan mencuci dengan air suling dari picette. Buang air cuci dengan mengetuk slide secara perlahan pada ujungnya, miringkan ke meja kerja.

4.- Biarkan pengeringan udara.

5.- Bergantung pada jenis pengamatan, coverlip digunakan atau tidak pada tahap ini. Selimut penutup melindungi dan mempertahankan noda. Jika pengamatan dilakukan dengan perendaman dalam minyak pada tahap ini, tidak ada penutup digunakan tetapi noda tidak dapat dipertahankan.

D. Pelestarian apusan apus secara definitif

1.- Benamkan apusan secara berturut-turut di setiap solusi yang ditunjukkan di bawah ini, selama minimal 5 menit. Tujuan dari "pemandian" ini adalah untuk membuat noda sepenuhnya dehidrasi. Setiap reagen harus dikeringkan, sebelum memasukkan apusan pada bak mandi berikutnya.

Urutan mandi dehidrasi adalah sebagai berikut:

  1. Etanol 70%
  2. 95% Etanol
  3. Aseton murni
  4. Campur aseton-xilol 1: 1
  5. Xilol

Kemudian biarkan udara mengering.

2.- Pasang penutup kaca, lebih disukai 22 × 22 mm, menggunakan balsam Kanada atau alat perakitan lainnya.

Referensi

  1. Briggs, G. (1965). Faktor Penyebab dalam Kecelakaan dan Infeksi Laboratorium Mikrobiologi. Laboratorium Biologi Angkatan Darat AS. Fort Detrick.
  2. Cappucino, J.G. dan Welch, C.T. (2017). Mikrobiologi: Manual Laboratorium. Pearson.
  3. Holt, J.G. Editor (1977). Manual Bergey yang lebih pendek dari Bakteriologi Determinatif. 8th Baltimore: The Williams and Wilkins Co.
  4. Johnson, T.R. dan Kasing; C.L. (2018). Eksperimen Laboratorium dalam Mikrobiologi. Pearson.
  5. Tille, P. (2017). Mikrobiologi Diagnostik. 14th St. Louis, AS: Elsiever, Inc.