Fungsi enzim restriksi, mekanisme aksi, tipe dan contoh



itu enzim restriksi mereka adalah endonucleases yang digunakan oleh archaea dan bakteri tertentu untuk menghambat atau "membatasi" penyebaran virus di dalamnya. Mereka sangat umum pada bakteri dan merupakan bagian dari sistem pertahanan mereka terhadap DNA asing yang dikenal sebagai sistem pembatasan / modifikasi.

Enzim-enzim ini mengkatalisasi pemotongan DNA beruntai ganda di lokasi tertentu, dapat direproduksi dan tanpa menggunakan energi tambahan. Sebagian besar membutuhkan kehadiran kofaktor seperti magnesium atau kation divalen lainnya, meskipun beberapa juga memerlukan ATP atau S-adenosyl metionin.

Pembatasan endonuklease ditemukan pada 1978 oleh Daniel Nathans, Arber Werner dan Hamilton Smith, yang menerima Hadiah Nobel untuk Kedokteran atas penemuan mereka. Namanya biasanya berasal dari organisme di mana mereka diamati untuk pertama kalinya.

Enzim seperti itu banyak digunakan dalam pengembangan metode kloning DNA dan biologi molekuler lainnya serta strategi rekayasa genetika. Karakteristiknya mengenali sekuens spesifik dan kemampuan untuk memotong sekuens dekat dengan situs pengenalan menjadikannya alat yang kuat dalam eksperimen genetika.

Fragmen yang dihasilkan oleh enzim restriksi yang bekerja pada molekul DNA tertentu dapat digunakan untuk membuat kembali "peta" dari molekul asli dengan menggunakan informasi tentang situs tempat enzim memotong DNA..

Beberapa enzim restriksi mungkin memiliki tempat pengenalan yang sama dalam DNA, tetapi mereka tidak harus memotongnya dengan cara yang sama. Jadi, ada enzim yang membuat potongan meninggalkan ujung tumpul dan enzim yang memotong meninggalkan ujung yang kohesif, yang memiliki aplikasi berbeda dalam biologi molekuler.

Saat ini ada ratusan enzim restriksi yang tersedia secara komersial, yang ditawarkan oleh berbagai rumah komersial; Enzim ini bekerja seperti gunting molekul "khusus" untuk tujuan yang berbeda.

Indeks

  • 1 fungsi
  • 2 Mekanisme tindakan
  • 3 Jenis
    • 3.1 enzim restriksi tipe I
    • 3.2 enzim restriksi tipe II
    • 3.3 enzim restriksi tipe III
    • 3.4 Enzim restriksi tipe IV
    • Enzim restriksi tipe V
  • 4 Contoh
  • 5 Referensi

Fungsi

Enzim restriksi melayani fungsi berlawanan dari polimerase, karena mereka menghidrolisis atau memutus ikatan ester dalam ikatan fosfodiester antara nukleotida yang berdekatan dalam rantai nukleotida.

Dalam biologi molekuler dan rekayasa genetika, mereka banyak digunakan alat untuk konstruksi ekspresi dan vektor kloning, serta untuk identifikasi urutan tertentu. Mereka juga berguna untuk pembangunan genom rekombinan dan memiliki potensi bioteknologi yang besar.

Kemajuan terbaru dalam terapi gen saat ini menggunakan enzim restriksi untuk memasukkan gen tertentu ke dalam vektor yang merupakan kendaraan untuk pengangkutan gen tersebut ke sel hidup, dan yang mungkin memiliki kemampuan untuk dimasukkan ke dalam genom sel untuk melakukan perubahan permanen.

Mekanisme tindakan

Enzim restriksi dapat mengkatalisasi pemotongan DNA untai ganda, meskipun beberapa mampu mengenali urutan DNA untai tunggal dan bahkan RNA. Pemotongan terjadi setelah pengenalan urutan.

Mekanisme kerjanya terdiri dari hidrolisis ikatan fosfodiester antara gugus fosfat dan deoksiribosa di tulang belakang setiap untai DNA. Banyak enzim mampu memotong di tempat yang sama dengan yang mereka kenali, sementara yang lain memotong antara 5 dan 9 pasang basa sebelum atau sesudahnya..

Biasanya enzim ini dipotong pada ujung 5 'dari gugus fosfat, sehingga menimbulkan fragmen DNA dengan ujung 5' fosforil dan ujung hidroksil terminal 3 '.

Karena protein tidak bersentuhan langsung dengan situs pengenalan dalam DNA, mereka harus ditranslokasi secara berturut-turut sampai mereka mencapai situs tertentu, mungkin dengan cara "meluncur" mekanisme pada untai DNA..

Selama pemotongan enzimatik, ikatan fosfodiester dari masing-masing untai DNA diposisikan dalam salah satu situs aktif enzim restriksi. Ketika enzim meninggalkan situs pengenalan dan pemotongan, ia melakukannya melalui asosiasi sementara non-spesifik.

Jenis

Saat ini, lima jenis enzim restriksi diketahui. Di bawah, deskripsi singkat tentang masing-masing:

Enzim restriksi tipe I

Enzim-enzim ini adalah protein pentamerik besar dengan tiga subunit, pembatasan, metilasi dan lainnya untuk pengenalan sekuens dalam DNA. Endonukleas ini adalah protein multifungsi yang mampu mengkatalis pembatasan dan modifikasi reaksi, mereka memiliki aktivitas ATPase dan juga DNA topoisomerase.

Enzim jenis ini adalah endonukleas pertama yang ditemukan, mereka dimurnikan untuk pertama kalinya pada 1960-an dan sejak itu mereka telah dipelajari dengan sangat mendalam.

Enzim tipe I tidak banyak digunakan sebagai alat bioteknologi, karena lokasi pemotongan dapat pada jarak variabel hingga 1.000 pasangan basa dari situs pengakuan, yang membuatnya tidak dapat diandalkan dalam hal reproduktifitas eksperimental.

Enzim restriksi tipe II

Mereka adalah enzim yang terdiri dari homodimer atau tetramer yang memotong DNA pada situs yang ditentukan antara 4 dan 8 bp panjangnya. Situs pemotongan ini biasanya palindromik, yaitu, mereka mengenali urutan yang dibaca dengan cara yang sama di kedua arah.

Banyak enzim restriksi tipe II pada bakteri memotong DNA ketika mereka mengenali karakter asing mereka, karena mereka tidak memiliki modifikasi khas yang dimiliki DNA sendiri..

Ini adalah enzim restriksi paling sederhana karena mereka tidak memerlukan kofaktor selain magnesium (Mg +) untuk mengenali dan memotong sekuens DNA.

Keakuratan enzim restriksi tipe II dalam mengenali dan memotong sekuens sederhana dalam DNA pada posisi yang tepat menjadikannya salah satu yang paling banyak digunakan dan sangat diperlukan di sebagian besar cabang biologi molekuler.

Dalam kelompok enzim restriksi tipe II adalah beberapa subclass yang diklasifikasikan menurut sifat-sifat tertentu yang unik untuk masing-masingnya. Klasifikasi enzim-enzim ini dilakukan dengan menambahkan huruf-huruf alfabet, dari A ke Z mengikuti nama enzim.

Beberapa subclass yang paling dikenal kegunaannya adalah:

Subkelas IIA

Mereka adalah dimer dari subunit yang berbeda. Mereka mengenali sekuens asimetris dan digunakan sebagai prekursor ideal untuk generasi enzim pemotongan.

Subkelas IIB

Mereka terdiri dari satu lagi dimer dan memotong DNA di kedua sisi dari urutan pengenalan. Mereka memotong kedua untai DNA dalam berbagai pasangan basa di luar situs pengenalan.

Subkelas IIC

Enzim jenis ini adalah polipeptida dengan fungsi pembelahan dan modifikasi untaian DNA. Enzim ini memotong kedua untai secara asimetris.

Subkelas IIE

Enzim dari subkelas ini adalah yang paling banyak digunakan dalam rekayasa genetika. Mereka memiliki situs katalitik dan umumnya memerlukan efektor alosterik. Enzim ini perlu berinteraksi dengan dua salinan dari urutan pengenalan mereka untuk membuat potongan yang efisien. Di dalam subclass ini adalah enzim EcoRII dan EcoRI.

Enzim restriksi tipe III

Endonucleases restriksi tipe III hanya terdiri dari dua subunit, satu bertanggung jawab untuk pengenalan dan modifikasi DNA, sementara yang lain bertanggung jawab untuk memotong urutan.

Enzim ini membutuhkan dua kofaktor untuk fungsinya: ATP dan magnesium. Enzim restriksi dari tipe ini memiliki dua situs pengenalan asimetris, mentranslokasi DNA dengan cara yang bergantung pada ATP dan memotongnya antara 20 hingga 30 bp yang berdekatan dengan situs pengenalan..

Enzim restriksi tipe IV

Enzim tipe IV mudah diidentifikasi karena mereka memotong DNA dengan tag metilasi, mereka terdiri dari beberapa subunit berbeda yang bertanggung jawab untuk mengenali dan memotong urutan DNA. Enzim ini digunakan sebagai kofaktor GTP dan magnesium divalen.

Situs khusus untuk memotong termasuk rantai nukleotida dengan residu sitosin yang dihidilasi atau dihidroksimetilasi dalam satu atau kedua untai asam nukleat.

Enzim restriksi tipe V

Klasifikasi ini mengelompokkan enzim tipe CRISPER-Cas, yang mengidentifikasi dan memotong sekuens DNA spesifik dari organisme penyerang. Enzim Cas menggunakan untaian CRNA yang dipandu yang disintesis CRISPER untuk mengenali dan menyerang organisme yang menyerang.

Enzim yang diklasifikasikan sebagai tipe V adalah polipeptida yang terstruktur oleh enzim tipe I, II dan II. Mereka dapat memotong bagian-bagian DNA dari hampir semua organisme dan dengan rentang panjang yang luar biasa. Fleksibilitas dan kemudahan penggunaannya menjadikan enzim ini salah satu alat yang paling umum digunakan dalam rekayasa genetika saat ini bersama dengan enzim tipe II..

Contohnya

Enzim restriksi telah digunakan untuk mendeteksi polimorfisme DNA, terutama dalam studi genetika populasi dan studi evolusi menggunakan DNA mitokondria, untuk mendapatkan informasi tentang laju penggantian nukleotida..

Saat ini, vektor yang digunakan untuk transformasi bakteri dengan tujuan berbeda memiliki situs multiklonache di mana situs pengenalan untuk beberapa enzim restriksi ditemukan..

Di antara enzim-enzim ini, yang paling populer adalah EcoRI, II, III, IV dan V, yang diperoleh dan dijelaskan untuk pertama kalinya. E. coli; HindIII, dari H. influenzae dan BamHI B. amyloliquefaciens.

Referensi

  1. Bickle, T. A., & Kruger, D. H. (1993). Biologi Pembatasan DNA. Ulasan Mikrobiologis, 57(2), 434-450.
  2. Boyaval, P., Moineau, S., Romero, D. A., & Horvath, P. (2007). CRISPR Menyediakan Perolehan resistensi terhadap virus pada prokariota. Sains, 315(Maret), 1709-1713.
  3. Goodsell, D. (2002). Perspektif molekul: Restriction Endonucleases. Fundamental Sel Punca dari Pengobatan Kanker, 20, 190-191.
  4. Halford, S. E. (2001). Hopping, jumping dan looping oleh enzim restriksi. Transaksi Masyarakat Biokimia, 29, 363-373.
  5. Jeltsch, A. (2003). Pemeliharaan identitas spesies dan mengendalikan spesiasi bakteri: fungsi baru untuk sistem pembatasan / modifikasi? Gene, 317, 13-16.
  6. Krebs, J., Goldstein, E., & Kilpatrick, S. (2018). Gen Lewin XII (12 ed.). Burlington, Massachusetts: Jones & Bartlett Learning.
  7. Li, Y., Pan, S., Zhang, Y., Ren, M., Feng, M., Peng, N., ... Dia, Q. (2015). Memanfaatkan sistem CRISPR-Cas Tipe I dan Tipe III untuk pengeditan genom. Penelitian Asam Nukleat, 1-12.
  8. Loenen, W. A.M., Dryden, D.T. F., Raleigh, EA., & Wilson, G.G. (2013). Enzim restriksi tipe I dan kerabatnya. Penelitian Asam Nukleat, 1-25.
  9.  Nathans, D., & Smith, H. O. (1975). Restriction Endonucleases dalam analisis dan restrukturisasi molekul DNA. Annu. Pdt. Biochem., 273-293.
  10.  Nei, M., & Tajima, F. (1981). Polimorfisme DNA dapat dideteksi dengan restriksi endonuklease. Genetika, 145-163.
  11.  Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., & Wende, W. (2005). Ilmu Seluler dan Molekuler Endonukleasi Tipe II restriksi: struktur dan mekanisme. CMLS Ilmu Seluler dan Molekuler, 62, 685-707.
  12.  Roberts, R. (2005). Bagaimana enzim restriksi menjadi alat kerja biologi molekuler. PNAS, 102(17), 5905-5908.
  13.  Roberts, R. J., & Murray, K. (1976). Pembatasan endonuklease. Ulasan Kritis dalam Biokimia, (November), 123-164.
  14.  Stoddard, B. L. (2005). Fungsi dan fungsi endonuclease rumah. Ulasan Triwulanan Biofisika, 1-47.
  15.  Tock, M. R., & Dryden, D. T. F. (2005). Biologi pembatasan dan anti-pembatasan. Opini Saat Ini dalam Mikrobiologi, 8, 466-472. https://doi.org/10.1016/j.mib.2005.06.003
  16.  Wilson, G. G., & Murray, N. E. (1991). Sistem Pembatasan dan Modifikasi. Annu. Pdt. Genet., 25, 585-627.
  17.  Wu, Z., & Mou, K. (2016). Wawasan genom ke dalam virulensi Campylobacter jejuni dan genetika populasi. Menginfeksi Dis. Terjemahkan. Med., 2(3), 109-119.
  18.  Yuan, R. (1981). Struktur dan Mekanisme Endonuklease Pembatasan Multifungsi. Annu. Pdt. Biochem., 50, 285-315.